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          華東師范大學李大力團隊研發超高活性基因編輯器

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            華東師范大學李大力課題組經過兩年多的艱苦攻關,研發出系列超高活性胞嘧啶堿基編輯器(hyCBE),這一系列新的基因編輯技術針對堿基突變引起的遺傳疾病,展示出基因治療的巨大潛力。該研究於5月11日在國際著名學術期刊Nature Cell Biology發表。

            “這一組堿基編輯系列新工具,在實現更高編輯效率和更寬編輯窗口的同時,仍然保持瞭其精準的工作性能。”課題組首席科學傢李大力說。

          課題組李大力研究員(右)博士研究生張曉輝

            同期發佈期刊評論中,美國威爾康奈爾醫學院癌癥生物學傢以《Base editing goes into hyperdrive》為題,指出這項 “‘超級編輯器’為疾病建模和基因治療提供瞭有效工具。”評論認為,李大力實驗室的工作豐富瞭BE工具箱,擴展瞭應用范圍,並證明瞭這些新工具具備更高效率和更寬范圍的堿基突變能力,在動物疾病模型中精確的錯義突變也顯示其治療潛力。

            “新型超級編輯器除瞭可應用於模型制作和疾病治療,還可以幫助我們提高BE工具技術性改造的認知以及獲取決定編輯效率的因素,這將為新工具研發提供合理性的設計指導,進一步推動基礎研究和臨床轉化的發展進程。”該評論文章說。

          雜志highlight評論 《Base Editing Goes Into Hyperdrive》

            活性百倍激升 精確構建遺傳疾病動物模型

            該研究將Rad51蛋白的單鏈DNA結合結構域融合到Cas9與脫氨酶之間,極大地提高瞭胞嘧啶堿基編輯器(CBE)的編輯活性,拓寬編輯窗口,因此將其命名為超高活性CBE(hyBE4max);類似地還改造出具有更寬的編輯窗口和更高活性的hyA3A-BE4max,以及能更高效識別TC堿基模塊中的C(胞嘧啶)而不引起其他C突變的hyeA3A-BE4max。

            “以hyeA3A-BE4max為例,在所檢測的靶點中,特定位點的編輯活性最高提高瞭257倍。”李大力說,“通過胚胎顯微註射,能在胚胎中精確改變單個堿基,直接獲得杜氏肌營養不良(DMD)小鼠模型,平均效率提高瞭近60倍。”

            除瞭能快速精確構建遺傳疾病動物模型,hyeA3A-BE4max在β地中海貧血的治療中也展現瞭顯著的優勢,實現真正單個堿基的突變,體外實驗證明有更好的治療效果。一系列嚴格的實驗表明,這一新編輯器具有非常高的精確性,沒有檢測到明顯的DNA和RNA脫靶,證明瞭新編輯工具用於基因治療的巨大潛力。

            華東師大團隊在基因治療領域發力前行

            近年歐美國傢已陸續批準瞭治療腺苷脫氨酶(ADA)缺乏性重度聯合免疫缺陷癥、脊髓性肌萎縮癥、β地中海貧血和萊伯氏先天性黑蒙癥等遺傳病的基因治療藥物。由於技術限制,已上市的藥物存在不能長期有效或者誘發腫瘤的風險,因此科學傢們不斷開發新的基因改造的技術,期望能夠克服現有技術的不足,實現一次治療終身治愈。

          前排左一為張曉輝,左三為陳亮,後排左二為朱碧雲

            以2012年發明的CRISPR/Cas9系統為代表的基因編輯技術是近年來最為火熱的分子生物學技術之一。華東師大生命科學學院劉明耀、李大力課題組在2013年在國際上率先建立瞭大鼠和小鼠胚胎的Cas9基因編輯技術,將基因修飾動物構建的時間由傳統方法的18個月縮短到5周左右,解決瞭基因治療研究中必不可少的疾病模型構建的問題。隨後利用Cas9技術修復瞭動物模型中的單個堿基突變,治愈瞭B型血友病,證明其在遺傳疾病治療中的潛力。然而,Cas9技術精確修復堿基突變的效率非常低,隻有1%左右,很難在更多的疾病治療中推廣。

            2016年美國科學傢開發的CBE技術,能在不產生DNA雙鏈斷裂的前提下,直接將目的片段一定范圍內的胞嘧啶轉化成胸腺嘧啶,實現C/G堿基對向T/A堿基對的轉換。今年年初,華東師大團隊發表論文,成功地利用CBE技術建立瞭人類造血幹細胞單堿基編輯技術體系,證明CBE有治療β地中海貧血的潛力,但存在編輯效率偏低、精準度有限等阻礙臨床應用的問題。

            “我們研發的超高活性堿基編輯技術基本解決瞭上述問題,有望成為遺傳疾病治療的首選堿基編輯器。”李大力說。

            據介紹,華東師大生命科學學院博士研究生張曉輝,碩士研究生陳亮和博士研究生朱碧雲為該研究的共同第一作者,華東師范大學為第一作者單位,李大力教授為本文通訊作者,劉明耀教授對本課題給予瞭悉心指導。該研究受到瞭科技部重點研發計劃、國傢自然科學基金以及上海市教委重大項目等經費的支持。

            延伸閱讀

            5月11日,華東師大生命科學學院李大力課題組在國際著名學術期刊Nature cell Biology發表瞭題為《Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-strand DNA binding protein domain》的研究論文,介紹瞭課題組最近開發的超高活性胞嘧啶堿基編輯器(hyCBE)。該堿基編輯新工具的開發,有望為基因治療提供自主研發的新工具,提升遺傳疾病基因療法精準性和長效性。

            據ClinVar 數據顯示,人類的遺傳病中58%是由於單個堿基突變引起的。雖然Cas9激活的同源重組可以實現對突變位點的精確修正,但效率非常低(0.1%~5%),嚴重阻礙瞭其應用。而通過將胞嘧啶脫氨酶與nickase Cas9(D10A)融合而成的胞嘧啶堿基編輯器BE3(Cytosine base editor, CBE), 在不引入DNA 雙鏈斷裂同時也不需要重組修復模板的情況下對編輯窗口(距離PAM遠端起的第4-7位)內的胞嘧啶脫氨,實現C>T的堿基轉換,具有更加安全、高效、精準的特點,在基因治療,農作物遺傳育種,藥物篩選等領域展示瞭廣泛的應用前景。自CBE被發明以來,多種策略對其進行瞭優化改進,雖然這些方法一定程度上提高瞭CBE的活性,但是對於編輯窗口的影響不大,特別是更靠近PAM序列的堿基仍然很難被編輯到。因此,是否有新的策略可以提高編輯活性而又能擴增靶向堿基的范圍,一直是堿基編輯器優化的難點。

            由於CBE主要是以單鏈DNA(ssDNA)為底物,因此研究團隊猜測如果增強脫氨酶與ssDNA的結合能力,是否能增加脫氨酶作用時間而增強活性呢?於是,通過對10個非序列特異性的ssDNA結合結構域(ssDBD)與CBE進行融合,通過篩選,發現將Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1與Cas9n之間能顯著提高堿基編輯活性,同時編輯窗口也大幅增加(圖1)。通過10個靶點的分析,在編輯窗口C4-C8中,hyBE4max比BE4max活性提高瞭1.5-2倍,而在C9-C15這些更靠近PAM的堿基中,活性最多提高瞭18倍。

          圖1. hyCBE模式圖及對不同ssDBD的篩選結果

            為瞭驗證融合ssDBD的策略是否具有通用性,用類似的方法改造A3A-BE4max和特異性識別TC motif中C堿基的eA3A-BE4max, 獲得瞭hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。通過大量的實驗證明,相比A3A-BE4max,hyA3A-BE4max活性在C3-C11位點提高瞭1.2-2倍,C12-C17位點活性提高3-4倍,通過小鼠胚胎顯微註射也進一步證明其在編輯更靠近PAM序列的堿基的獨特優勢。與eA3A-BE4max 相比,hyeA3A-BE4max任然能非常特異性地靶向TC motif中的C,編輯窗口由C4-9拓展為C4-15,活性最高提高瞭 257倍,而在小鼠胚胎中在C13位的編輯活性也提高瞭近60倍,F0代小鼠獲得DMD純合點突變的效率達到40%。

            論文進一步驗證hyCBEs特別是hyeA3A沒有檢測到DNA或者RNA層面的脫靶,具有非常高的精準性。最後,通過比較多種CBE在編輯胎兒血紅蛋白(HBG1/2)啟動子-117位點的能力發現,hyeA3A能在紅細胞前體細胞系中精確催化-117G>A的轉換,而周圍同時發生堿基突變(by stander mutation)的細胞相比,具有更高的HBG表達水平,展示瞭 hyeA3A-BE4max 對於精準治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。該工作開發瞭能提高編輯活性拓寬靶點范圍的一些列新的CBE,為基礎研究與基因治療提供瞭新的優化工具。

            華東師大生命科學學院博士研究生張曉輝,碩士研究生陳亮和博士研究生朱碧雲為該論文的共同第一作者,華東師范大學為第一作者單位,李大力教授為本文通訊作者,劉明耀教授對本課題給予瞭悉心的指導,同濟大學毛志勇教授課題組在實驗室提供瞭重要支持,該研究受到瞭科技部重點研究發計劃、國傢自然科學基金以及上海市教委重大項目等經費的支持。